HPLC y pureza de péptidos

Qué mide realmente la cromatografía líquida de alta resolución

La HPLC de fase reversa separa moléculas según su interacción con una fase estacionaria hidrofóbica, generando tiempos de retención distintos para especies con polaridad diferente. El resultado es un cromatograma donde el área bajo cada pico es proporcional, de forma aproximada, a la cantidad relativa de esa especie en la muestra.

Interpretar el área de pico correctamente

El porcentaje de pureza reportado se calcula típicamente como el área del pico principal dividida entre el área total de todos los picos detectados. Esta cifra es una pureza relativa entre especies con comportamiento cromatográfico similar, no una medida absoluta de concentración molar.

Limitaciones del método

La HPLC no distingue, por sí sola, entre dos compuestos que coeluyen exactamente en el mismo tiempo de retención. Por eso un COA robusto complementa el cromatograma con espectrometría de masas, que confirma la identidad molecular independientemente del comportamiento cromatográfico.

• Área relativa, no concentración molar absoluta
• Sensible al método y columna utilizados
• Debe complementarse con espectrometría de masas para identidad